我国草坪草转基因研究进展

    草坪是现代化都市中不可缺少的生态环境组成部分,不仅具有保持水土、改造自然、美化环境、改善生态环境等功能,而且可以提供高质量的运动和休憩场地,如各种民居环境、城乡绿地、运动场等。经过选择和重组,已培育了大量的冷季型和暖季型草坪草。
    近年来,随着体育事业和现代园林绿化事业的发展,草坪质量的优劣已越来越被世界上许多国家所重视。
    随着2008年北京奥运会和2010年上海世界博览会的临近,中国草坪业将迎来新一轮的大发展。用传统的育种方法要达到抗除草剂、抗病虫、抗盐碱等非常困难,但把转基因技术融合到传统的育种手段中,不仅可拓展改良的范围,而且也有助于解决一些常规育种方法难于解决的特殊问题。因此,扩大基因的来源,将一些特殊性状的基因引入现有的草坪植物是十分必要的。
1　草坪草的组织培养
    组织培养阶段是大多数转基因技术所必需的过程。采用转基因技术培育植物新品种,首先要建立植物细胞或原生质体培养及植物再生体系。组织培养是对植物进行遗传转化操作的前提,一个高效遗传转化体系首先是个好的组织培养再生体系,建立一个高效组培体系取决于基因型、合适的外植体和培养基组成。1988年Vasil曾指出建立一个可分化的细胞培养体系应做到以下点:  (1)外植体应选择分生组织、未分化细胞(如成熟种子、成熟或未成熟胚和叶基部或幼嫩的花序);(2)应用较多的是高盐的MS培养基,其中需添加高浓度的生长素(如2,4-D或Dicamba等)和低浓度的细胞分裂素(如6-BA等),用来诱导愈伤组织的产生。蛋白水解物及有机氮化合物(如L-脯氨酸和谷氨酰胺)也能促进愈伤组织的诱导;(3)尽量用胚性愈伤组织分离原生质体。由于早期采用已成熟和分化的组织作外植体,难以脱分化形成愈伤组织,使得草坪草体外培养的研究进度较慢。组织培养技术在草坪草上的应用只是近几年的事情,主要是因为草坪草作为单子叶植物,试管繁殖及分化再生有难度,其应用目的除了为繁殖少量的优良种质资源外,主要是进行遗传育种的探索。
2　利用转基因技术进行草坪草育种
    目前主要的禾本科草坪草的转基因技术已在不少实验室获得成功。转化的草坪草包括结缕草属(Zoysia)、早熟禾属(Poa)、黑麦草属(Lolium)、羊茅属(Festuca)、剪股颖属(Agrostis)、狗牙根属(Cynodon)、野牛草属(Buchloe)、雀稗属(Paspalum)、鸭茅属(Dactylis)、蜈蚣草属(Eremochlon)、钝叶草属(Stenotaphrum)等种属。利用转基因技术从其他的有机体引入特异性状的目的基因,使草坪草具有抗除草剂、抗病虫、抗旱、耐寒、耐盐碱等特性。
2.1.1　抗除草剂　
    杂草防除不及时,就会影响草坪的生长并降低观赏性能,严重者使整个草坪荒废。因此,能否有效防除杂草成了草坪管理中的一个重要内容。目前,我国大多采用人工除草,不仅成本高、效率低,而且防除不彻底。但应用除草剂不仅效率高、除杂彻底,且降低了除草成本。
    1996年,密歇根州立大学Liu将带有抗除草剂的bar基因导入匍匐剪股颖,使其编码一种酶PAT(一种放线菌的酶),该酶能使除草剂(有效成分phosphinothricin,PPT)失活,从而达到抗除草剂的目的;1998年,Lee等也报导了转基因匍匐剪股颖和非转基因对照植株对除草剂Herbiace(有效成分PPT)的抗性试验,证明转基因植株对除草剂的抗性很强,而且所有在温室抗除草剂的株系移至大田后,均能在除草剂喷施后存活,同时它的种子能在除草剂存在下萌发;之后不久,Zhong等发现bar基因的匍匐剪股颖能抵抗除草剂的伤害,喷施12%的Ignite(有效成分PPT),对照植物全部死亡,38个转基因株系中有37个株系不受除草剂的任何伤害。这说明转基因植株表现了对PPT很高的抗性。转bar基因的匍匐剪股颖在施用除草剂bialaphos后,具有明显的抗病效果,抑制了三种病害的发生,对褐斑病和币斑病的防治效果尤佳。2000年,浙江大学柴学良以农杆菌介导法,建立草坪草(剪股颖,结缕草)的转基因程序,并将抗除草剂、抗旱和抗真菌病害的有用基因整合到目标材料中,首次通过农杆菌技术获得了转基因草坪草。北京大学的林忠平将抗草甘膦的基因转入草坪草。2003年,LiL等用狗牙根草花序诱导出的愈伤组织进行遗传转化,将含有抗除草剂基因和GUS基因的载体转入狗牙根草,用潮霉素筛选出再生植株,获得的三个转基因植株系对除草剂glufosinate均表现明显抗性。
    因此,培育抗除草剂的草坪草新品种,利用转基因植物抵抗除草剂的伤害是一项很有意义的研究,施用除草剂一方面杀死了杂草,又可防治存活的转基因植物的病害。
2.1.2　抗病虫性　
    建坪后的管理是草坪工作者最为关注的环节,也是缩短我国草坪质量和国外差距的根本所在。据不完全统计,我国每年用于建坪的进口草种达100t以上,建植各类草坪约5hm2。但因病虫害类型不同和存在地域性的差异,导致病虫害问题频频发生,引起草坪质量明显下降和严重退化。美国有将近7亿美元被用来消费在杀菌剂、杀虫剂以及植物生长调节剂等上面。病虫害严重影响草坪美观和功能,尤其是高尔夫球场和运动场草坪,因而在草坪养护上需大量使用杀菌剂,以控制病害的发生。但杀菌剂的大量使用,造成环境污染、危害人类身心健康。应采取生物防治、加强多抗新品种的选育,减少杀菌剂、杀虫剂的施用量,从而减轻对环境的危害。
    目前已经从植物和真菌中克隆了各种各样抗病基因,并且在草坪草遗传转化中已发挥了作用。匍匐剪股颖是在高尔夫球场中常用的一种草坪草,很容易感染许多真菌病原体,只能用真菌剂来控制疾病。Wang等将抗除草剂Glufosinate的bar基因分别转入匍匐型和光滑型剪股颖,在用560mg/LGlufosinate除草剂处理前或处理后,分别接种真菌病原体丝核菌和核盘菌,结果发现,在接种真菌3h之前或接种真菌1d之后用除草剂喷洒处理,则都能有效的抑制真菌病原体对转基因植株的感染。匍匐剪股颖最容易患一种由Sclerotinahomeocarpa引起的硬币元状斑病,这也正是高尔夫球场病害防治中花费最高的。ZhenfeiGuo等利用转基因技术把从Arabidopsisthaliana中克隆的一个基因转入匍匐剪股颖,使其表达一种受体蛋白激酶(PR5K),这种蛋白位于细胞外的区域与发病机理相关的PR5家族的蛋白质高度同源。然后用真菌硬币元状斑病病原体给转基因植株做接种试验,结果发现,相对于非转基因对照植株而言,有1/2的转基因株系在29～45d内表现出发病延迟。然而经过继续观察发现,一旦转基因植株发病,也会和非转基因植株一样严重,因此利用转基因技术进行抗病育种还有很长的路要走。
2.1.3　耐寒性、节水抗旱性及耐盐性
　 绿化使用的草坪草可分冷季和暖季2种类型,当前尚未见四季常绿的草坪草品种。冷季型草坪草在冬季低温条件下表现为正常绿色,夏季高温条件下进入休眠期,叶片变为枯黄。相反,暖季型草坪草则在夏季高温下呈正常绿色,冬季低温下叶片表现枯黄。提高暖季型或冷季型草坪草的耐寒性或耐热性,延长绿叶期是园林绿化者的追求。引入抗热、耐寒及持绿基因,培育抗热、耐寒的常绿草坪草新品种,延长草坪绿期、改善草坪景观,培育抗旱、耐盐等抗逆性强的草坪草新品种,对严重缺水区域、盐碱区域有很大的应用价值。目前已有不少抗旱、耐寒基因被克隆,在模式植物中提高抗旱、节水性已得到证明,因此将这些基因导入草坪草以提高其抗旱、节水性已有很好的技术积累,这些抗旱、耐寒、节水草坪草的培育成功和野生草类资源的改良驯化将成为城市绿化和荒漠植草、抑制沙尘暴等环境保护的重要措施。
2.1.4　纯天然彩色草坪草
　 传统的绿色草坪将成为过去,科学家们正在开发各种颜色的新草坪。由于缺乏其它颜色的草坪草专用品种,在绿化中只能利用颜色单一的绿色草坪。实际生活中,运动场和高尔夫球地,尤其是每逢重大赛事和重要庆祝活动等,纪念文字、吉祥物和标志物等彩色图案的配置往往不得不采用化学染料。迄今为止,国内外关于彩色草坪草培育成功的研究报道很少。
3　转基因草坪草的生物安全性问题
    转基因草坪工业在蓬勃发展的同时,也带来许多问题。由于转基因植物的基因来源已拓宽到动物、植物、微生物甚至人工合成基因,这些新性状会不会影响人类生存,是否对生态环境带来风险还未可知,因此应用前有必要对转基因植株进行田间试验作出安全性评价。转基因草坪草的生物安全性问题主要是花粉途径的基因漂移是否会引发潜在的生态安全,也就是说在向大田释放时具风险性,主要表现在转基因草坪草与杂草的问题上。
    一些研究者认为,转基因草坪草在技术上已成熟,有必要加速转基因草坪草的商业化进程,他们认为获得抗虫和抗病的草坪草可以有效的遏制滥用大量有害化学药剂,而对生态环境起到保护作用。在城市绿地和运动场所中的草坪草通常依靠修剪来养护,不使其开花结实。因此,在人居环境中一般不会出现基因逃逸(geneescape)现象。Wipff及其同事设计了多种方案来探索在自然群体中transgene向野生草类漂移的可能性。大多数草坪草自交传粉,异交率甚低,而且颖壳开放时间短,种属间杂交的情况很少。
    另外,一些研究者通过选育高抗除草剂的品系,在草籽生产地,通过使用除草剂灭杀野生的一年生结缕草来排除因基因交流而影响商用草籽的纯度。通过多种技术措施阻断花粉途径的基因漂移,将不安全的因素降至最低是可以做到的,因而多数草坪草的基因漂移问题不难克服。因此,转基因草坪草向大田释放要谨慎,确保这柄“双刃剑”的正确使用。关于基因逃逸和生态安全问题还在研究和争论之中。
4　问题和前景
    转基因草坪草的基因来源广泛,针对性强,可以将特定的目的基因直接转化到需要改良的特定草坪草品种中;所需周期短,省时省力;获得的一些品种能弥补传统育种周期长、效率差的缺陷。至今为止,仅匍匐剪股颖和苇状羊茅有子代遗传稳定性的研究,其它种类仍局限在转化研究为主。与大多数商品性转基因作物一样,转基因草坪草也主要为单基因性状的改变,最常见的是引入抗除草剂的bar基因或pat基因,也有少量含抗广谱真菌病害的壳多糖酶(chitinase)基因。前一种转基因草坪草仅抗一类特定的除草剂;而后一种在抗病性表达的强度上还存在局限性。同时,由于其抗性基因是转入到核染色体中的,有通过花粉途径传入同类杂草,从而引起杂草具有抗性的严重问题。转基因技术虽存在一些问题,但已取得了很多成就,获得了一些转基因植株。随着草坪草高效组培再生体系的建立、遗传操作技术的完善及信息传导、基因高效表达等基础研究的发展,以基因转化手段改良草坪草遗传品质具有诱人前景。正是因为在草坪草品种改良中的巨大应用潜力,目前国内外的许多公司
    和实验室都在开展抗逆等方面的转基因研究。总之,转基因技术对草坪草的遗传改良发挥着重要作用,是现代草坪草新优品种繁育的主要手段之一,加之与其它生物技术及传统育种方法的有机结合,必将对草坪业的发展产生巨大的推动作用。